PCR Primer 디자인 방법

Primer 짜기

1. 길이는 18-22bp

– 너무 짧으면 특이성이 떨어지고 너무 길면 tempalte에 결합하기가 힘들다

2. Tm (Melting Temperature)는 52-58도

– GC content에 의해 Tm값이 결정된다. 너무 높으면 secondary annealing이 될 수 있다. 대개 primer design할 때 값이 주어짐

3. Ta (Annealing Temperature)

– Ta 값이 너무 높으면 product yield가 떨어지고, 너무 낮으면 nonspecific product가 많아진다

4. GC content는 40-60%

– 우리 연구실에서는 55%를 선호한다.

5. GC Clamp

– Primer 3′ 끝부분에 결합력이 강한 GC가 5개 중 3개가 있는 것이 좋다.

6. Primer Secondary structure

– Hairpin, Self-dimer, Cross-dimer 등이 형성되면 yield가 급격하게 떨어진다.

7. Repeats

– ATATATAT와 같이 repeat가 있으면 어긋나서 결합할 수 있다. 4bp이상 반복이 없도록 하자.

8. Runs

– AGCGGGGGATGGGG와 같이 single base run이 들어가면 Repeat와 비슷한 이유로 mispriming이 될 수 있다. 4bp이상 반복이 없도록 하자.

9. 3′ End Stability

– 3′ end의 delta-G value가 높으면 (음수값이 작으면) false priming이 될 수 있다.

10. Template secondary structure

– Template도 secondary structure를 이룰 수 있다.

11. Cross Homology

– 다른 gene과 homology를 가지는 부위는 피하도록 한다.

사실 이런거 몰라도 primerblast 기본 세팅으로 놓고 짜면 되긴 한다.

여기서 exon-exon junction spanning되는 것 2개, 안하는 것 2개 정도 선택한 후에 주문하고, PCR 돌려서 product 잘 나오는 걸 선택해서 연구를 진행했다. 어차피 primer는 antibody와 달리 가격이 싸서 시행착오를 거쳐도 된다.