Primer 짜기
1. 길이는 18-22bp
– 너무 짧으면 특이성이 떨어지고 너무 길면 tempalte에 결합하기가 힘들다
2. Tm (Melting Temperature)는 52-58도
– GC content에 의해 Tm값이 결정된다. 너무 높으면 secondary annealing이 될 수 있다. 대개 primer design할 때 값이 주어짐
3. Ta (Annealing Temperature)
– Ta 값이 너무 높으면 product yield가 떨어지고, 너무 낮으면 nonspecific product가 많아진다
4. GC content는 40-60%
– 우리 연구실에서는 55%를 선호한다.
5. GC Clamp
– Primer 3′ 끝부분에 결합력이 강한 GC가 5개 중 3개가 있는 것이 좋다.
6. Primer Secondary structure
– Hairpin, Self-dimer, Cross-dimer 등이 형성되면 yield가 급격하게 떨어진다.
7. Repeats
– ATATATAT와 같이 repeat가 있으면 어긋나서 결합할 수 있다. 4bp이상 반복이 없도록 하자.
8. Runs
– AGCGGGGGATGGGG와 같이 single base run이 들어가면 Repeat와 비슷한 이유로 pispriming이 될 수 있다. 4bp이상 반복이 없도록 하자.
9. 3′ End Stability
– 3′ end의 delta-G value가 높으면 (음수값이 작으면) false priming이 될 수 있다.
10. Template secondary structure
– Template도 secondary structure를 이룰 수 있다.
11. Cross Homology
– 다른 gene과 homology를 가지는 부위는 피하도록 한다.
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International License.